Revista Industria Cosmética - Número 29

Tag II a la secuencia N-terminal y la etiqueta 6×His a la secuencia C-terminal para su purificación. Después de determinar la secuencia de aminoácidos de la SRHC de tipo XVII, buscamos las células chasis adecuadas para la fermentación. Los sistemas de expresión más utilizados para la producción de proteínas recombinantes incluyen el sistema de expresión procariota (por ejemplo, E. coli), el sistema de expresión eucariota (por ejemplo, Pichia Pastories), el sistema de expresión de células de insecto (baculovirus) y el sistema de expresión de células de mamífero. La proteína recombinante producida por células de mamífero implica un elevado coste de expresión y no es adecuada para la producción masiva de materias primas de cosméticos. El sistema de expresión de células de insecto (baculovirus) no sólo tiene un coste elevado y un rendimiento bajo, sino que también muestra una enorme diferencia con las células humanas en la post-traducción. Aparte de estos dos métodos, la proteína recombinante obtenida mediante el sistema de expresión de E. coli no tiene modificación postraduccional y la expresión secretora es difícil de conseguir en E. coli . Por lo tanto, es necesaria la lisis celular para la purificación de las proteínas diana. Sin embargo, la pared celular de las bacterias gram negativas se conoce como endotoxina, cuya eliminación requiere complicados procesos de purificación, lo que supondrá un gran aumento del coste. En vista a estas evidencias, decidimos seleccionar Pichia Pastories para la producción de SRHC tipo XVII. La expresión secretora es una técnica probada en el sistema de expresión de levaduras mediante la adición de péptidos secretores a la secuencia codificante [10]. Además, Pichia Pastories tiene capacidad de modificación post-traduccional, y esto es esencial para el mantenimiento de la bioactividad de las proteínas recombinantes originadas a partir de proteínas humanas. PRODUCCIÓN A ESCALA MEDIANTE FERMENTACIÓN BIOLÓGICA CON PICHIA PASTORIES DE SRHC TIPO XVII En primer lugar, optimizamos la secuencia de bases de la SRHC tipo XVII de acuerdo con el sesgo de uso de codones de Pichia Pastories. Después, la secuencia codificante se insertó en el plásmido pPIC9K y el plásmido resultante pPIC9K-C170801 se electroporó en Pichia Pastories tras su verificación mediante secuenciación de ADN (Fig.1). Comprobamos el nivel de expresión de SRHC tipo XVII en diferentes cepas y seleccionamos la cepa con mayor nivel de expresión (denominada 170801) para la fermentación a escala. Realizamos un análisis SDS-PAGE del sobrenadante de 170801 después de la fermentación y descubrimos que había una única banda clara (Fig. 2A). Además, adoptamos Western Blot para confirmar que la banda clara es sólo SRHC Tipo XVII con α-factor secretion signal pPIC9K-C170801 10,008 bp Figura 1. Ilustración esquemática del plásmido utilizado para la expresión recombinante de SRHC tipo XVII. 76 INDUSTRIA COSMÉTICA 029 SEP/OCT 2023 biotecnología cosmética